一、温度
一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度是37~38℃。温度过高或过低都会影响到细胞的生长。细胞耐受低温的能力比抗热的能力强，在低温下，细胞的代谢活力及核分裂降低。温度不低于0℃时，虽影响细胞代谢，但并无伤害作用；把细胞置于25～35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度减缓；放在40℃数小时后，再置回37℃培养细胞仍能继续生长。但如果在40℃下暴露时间太长，对细胞生长不利，甚至变圆脱落于瓶壁。若温度过低，在降到冰点以下时，细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡。但若向培养液中加入甘油或二甲亚砜等保护剂，封入安瓿中后，置于液氮中，可起保护作用，此时细胞可耐受-70℃以下温度，能长期储存，解冻后细胞复苏，仍能继续生长增殖，细胞生物性状不受任何影响。此为保存细胞的主要手段。
高温对细胞培养不利。细胞在39～40℃培养1小时，能受到一定损伤，但仍有可能恢复，但不能忍受温度再升高2℃，持续数小时，即在41～42℃中培养1小时，细胞损伤严重，温度至43℃以上时细胞多数被杀死。高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏，核分裂的破坏，产生凝固酶使细胞发生凝固，另外使蛋白质变性。因此，体外培养细胞时一定要避免高温。
二、渗透压
细胞在高渗溶液或低渗溶液中，可以立即发生皱缩或肿胀、破裂。所以，渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。哺乳动物和其他动物组织细胞体外培养的渗透压的维持主要与NaCl有关，但不能忽视其他电介质渗透压的关系。渗透压与单位体积溶媒内溶质的分子数和离子数成正比。为此，按一定比例控制培养液中离子平衡，维持正常渗透压是很重要的。这不仅是为了维持细胞张力，而且是为了调节细胞的代谢。因为细胞外离子输送和离子浓度改变着其他营养物质的输送（如氨基酸、蔗糖等），直接影响细胞基本合成系统。
理想的渗透压因细胞的类型及种族而异，人血浆渗透压为290mmol/L，被视为是体外培养人类细胞的理想渗透压。哺乳类动物细胞的渗透压一般为290～300mmol/L。人胚肺成纤维细胞为250～325mmol/L，鼠则为310mmol/L左右。在实际应用中，260～320mmol/L的渗透压可适于大多数细胞。
三、气体环境和pH
体外培养细胞需要理想的气体环境，氧和二氧化碳是细胞生存必须的条件之一。氧参加细胞的三羧酸循环，产生能量以供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。有些细胞在低氧条件下，可借糖酵解取得能量，但多数细胞低氧时不能生存。氧张力通常维持在略低于大气状态，若氧分压超过大气中氧的含量可能对有些细胞有害。采用开放式培养时（碟皿或培养瓶松盖培养或培养板培养），一般要把细胞置于95%空气加5%二氧化碳的混合气体环境中。
CO2既是细胞的代谢产物，又是细胞生长所必需的成分，并与维持培养液的pH有关。在密闭瓶中CO2浓度偏低的情况下，细胞容易生长；一般不能低于1%，否则有损细胞。CO2增加将使pH下降。大多数细胞适于在pH7.2~ pH 7.4条件下生长，低于pH6.8或高于pH7.6对细胞有害，甚至退变或死亡。各种细胞对pH的要求不尽相同。一般原代培养细胞对pH的变动耐受性差，永生性细胞系和恶性细胞对pH的变动耐力强。但总的来说，细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。细胞在生长过程中随细胞数量的增多和代谢活动的加强，不断释放CO2，使培养基变酸，pH发生变化。所以，为了维持培养环境恒定的pH，多采用在培养液中加入磷酸盐等缓冲剂的方法。磷酸缓冲剂中的NaHCO3可供给CO2，但CO2易于逸出，故只适用于封闭式培养。若开放式培养还是置于含有5%CO2的气体环境中为宜。为克服NaHCO3调整的麻烦，也可用羟乙基哌嗪乙硫磺酸（N-2-hydroxyethyl piperazine-N'-ethanesulfonic acid, Hepes），它对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要作用是防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH。
四、无毒和无菌
无毒和无菌是体外培养细胞的首要环境条件。细胞在活体内，偶尔有细菌或有害物质入侵，因体内有强大的解毒系统和免疫系统，可将其解毒或清除，而不易受损害。但在离体的环境中，失去了防御系统，一旦有害物质入侵或细菌污染，可导致细胞死亡，前功尽弃。如培养瓶皿、支持物、培养基、瓶盖、瓶塞上若有细胞毒性，在培养过程中可导致细胞死亡。因此，在选用这些器皿、材料时要注意，若这些物品消毒不*，带菌或操作过程不小心使细胞污染，也会导致细胞死亡。若出现交叉污染，可使实验室原来的细胞系失去原有特性，应引起足够的重视（后面有详述）。
五、辐射线和超声波
（一）可见光
可见光的波长是3900~7800Å。可见光的各种有色光能引起细胞退变，延长核分裂的间期，还可显著降低细胞的附壁能力。因此，体外培养细胞应避免日光直接照射，在黑暗中进行培养或短期存放。
（二）紫外线
弱紫外线下耐受能力强的细胞变化不大，但对敏感的细胞有损害。紫外线强时，新分离的细胞显示：不能进行*的有丝分裂；在有丝分裂时增加了脱水收缩；在有丝分裂时细胞质的起泡减少。Elrlich腹水癌细胞经紫外线照射后，用飞点紫外线显微镜观察发现被照射表面形成水泡，随后细胞膨胀，损害也渐变严重。
（三）放射线
X射线对细胞有明显损伤。β射线可影响细胞核的分裂。γ射线使核分裂数减少并出现不正常的核分裂，可使细胞死亡。
（四）超声波和振动
在超声波振动下，细胞很快会破裂，开始是胞质发生紊乱的流动，原生质胶体结核也有明显变化，若停止超声波振动可回复。细胞致死的原因是由于产生空化作用所致。当超声波在2.5W/cm2时，细胞受损，染色体发生畸变，首先发生畸变的是核染色体。
六、细胞接种浓度（密度）
在体外培养细胞中，细胞接种数对细胞的生长有影响，适宜的接种密度，可以促使细胞增殖，接种密度太低或太高都不利于细胞的生长增殖。如果培养液与细胞的容积比例大于2000:1，生长物质弥散到细胞外的比例将是细胞内达到低于zui小限度的浓度，此时细胞不能再增殖，培养液中的pH变碱，抑制细胞生长，细胞变圆不能贴壁，甚至引起细胞死亡等。如果接种密度太高，每个细胞周围培养液的容积降至0.007mm3以下，由于弥散率的降低，细胞内生物质的浓度增加，容易使排除物或其他代谢产物达到饱和，能量来源也很快耗尽，因此也会妨碍细胞的增殖。
如何选择适宜的接种浓度要根据细胞的代谢和生长繁殖速度以及工作的需要而确定。一般来说，细胞代谢旺盛、生长速度快的细胞如肿瘤细胞，接种浓度宜偏低；而正常组织细胞生长较慢，代谢不够旺盛，接种浓度可偏高；如果是为了保种或不需急用，接种浓度可偏低些；有时为了便于观察细胞形态结构，接种浓度也可适当降低。
七、容器转动速度和悬浮搅动速度
有时为了研究的需要而将培养细胞在容器中进行旋转或搅动，如贴壁细胞在旋转管中培养，使转鼓的转速提高，细胞增殖率随之提高。其原因可能是转动使足够的营养流动和较充分的氧化作用之故。
当悬浮搅拌培养细胞时，搅拌速度既不能太快，也不能太慢。如太慢，细胞易结团、下沉和贴壁，不利于细胞在悬浮状态下增殖。如果太快，容易起泡沫，细胞易窒息致死，同时，强烈地搅动易使细胞因机械损伤而破裂。所以选择适宜的搅拌速度很重要。如BHK21的搅拌速度适宜为460~330r/min；淋巴细胞（Raji）株，在200 r/min 和400 r/min 时细胞数不增不减，或稍有下降，而搅拌速度增加到600 r/min时出现生长；类淋巴细胞（Namalva）生长速度快，在80~100 r/min 时既不结团，又不需加抗泡沫剂，且细胞生长仍然很快。各种细胞的适宜搅拌速度不一致，通常与细胞的特性和质量有关，予以注意。