实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人乙肝表面抗原(HBsAg)表达。用纯化的人乙肝表面抗体包被微孔板,制成固相抗体,可与样品中乙肝表面抗原(HBsAg)相结合,经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的乙肝表面抗抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过*洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),与CUTOFF
值相比较,从而判定标本中人乙肝表面抗原(HBsAg)的存在与否。
试剂盒组成
1、30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7终止液 6ml×1瓶
2、酶标试剂6ml×1瓶8阳性对照0.5ml×1瓶
3、酶标包被板12孔×8条9阴性对照 0.5ml×1瓶
4、样品稀释液6ml×1瓶10说明书1份
5、显色剂A液6ml×1瓶11封板膜2张
6、显色剂B液6ml×1/瓶12密封袋1个
标本要求
1.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融
2.不能检测含NaN3 的样品,因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
操作步骤
1. 编号:将样品对应微孔按序编号,每板应设阴性对照2 孔、阳性对照2 孔、空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)
2. 加样:分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,
3. 温育:用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。
4. 配液:将30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用
5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30 秒后弃去,如此重复5次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。
7. 温育:操作同3。
8. 洗涤:操作同5。
9. 显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.
10. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11. 测定:以空白空调零,450nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
计算和结果判定:
试验有效性:阳性对照孔平均值≥1.00; 阴性对照平均值≤0.10
临界值(CUT OFF)计算:临界值=阴性对照孔平均值+0.15
阴性判定:样品OD 值< 临界值(CUT OFF)者为乙肝表面抗原(HBsAg)阴性
阳性判定:样品OD 值≥ 临界值(CUT OFF)者为乙肝表面抗原(HBsAg)阳性
。
注意事项
1.操作严格按照说明书进行,本试剂不同批号组分不得混用。
2.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
3.浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。
4. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
5.底物请避光保存。
6.试验结果判定必须以酶标仪读数为准,使用双波长检测时,参考波长为630nm
7.所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为2M 的硫酸,使用时必须注意安全。
保存条件及有效期
1.试剂盒保存:2-8℃。
2.有效期:6 个月