1. 细胞壁的消化，将细菌温育在裂解液中去除细胞壁中的肽聚糖。通常在等渗的情况下进行此步，以防止细胞涨破释放出染色体DNA分子。注意，革兰氏阳性菌对裂解酶相对不敏感，需要额外的处理以使酶到达细胞壁层，例如，可采用渗透压休克或保温在螯合剂中，如EDTA。EDTA也能使一些细菌的脱氧核糖核酸酶失活，以防止在提取过程中，质粒DNA降解。

2. 利用强碱（NaOH）和其他试剂，如十二烷基磺酸钠溶解细胞膜并使蛋白质部分变性。再中和此溶液使不溶性染色体DNA沉淀，质粒DNA存于溶液中。

3. 移去其他的大分子物质，特别是RNA和蛋白质，这可利用核糖核酸酶和蛋白酶进行酶促消化。另一些化学纯化步骤可增加质粒DNA的纯度，例如可将提取物同水饱和酚或酚/氯仿混合物混合，以除去蛋白质。再离心，DNA留在上面的水层，蛋白质则分离在下面的有机溶剂层。重复酚/氯仿提纯的循环可降低样品中这些大分子蛋白的含量到zui少。还可通过等密度的CsCl梯度离心法得到纯化的DNA。

4. 利用体积分数为70%左右的乙醇沉淀DNA，离心，得到的DNA沉淀，再用体积分数为70%的乙醇洗，其中的水将除去先前阶段的盐污染。经过提纯的DNA，可冷冻保存备用，或重新溶解在缓冲液中。