实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR原理
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，zui后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 -- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：
1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的技术平台。
2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加*同步。
1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，zui终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
实时荧光定量PCR技术
2．内标在传统定量中的作用
由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（见图4），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
编辑本段内标对荧光定量PCR的影响
有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性*，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方。
实时荧光定量PCR仪是*的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。
综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量zui准确，重现性的定量方法，已得到*的*，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
荧光PCR是分子诊断的热点技术，它将先进的定量PCR与实时PCR技术相结合，国产实时荧光定量PCR仪为肝炎艾滋病等重大疾病的定量核酸检测及分子诊断、同时也为沙门氏菌阪崎氏肠杆菌等食品安全检测提供了先进手段。即使在发达国家，荧光定量PCR仪和基因扩增仪都被广泛用于临床及生物学、医学研究。由于其*的灵敏度、极宽的检测范围，以及定量、方便快速、无窗口期等优点，美国FDA及我国国家标准已将定量PCR仪规定为确诊禽流感等传染病以及奶粉等食品安全检测的*仪器。
实时荧光定量PCR仪（real-time qPCR）的发明实现了荣获诺贝尔化学奖的PCR核酸检测、分子诊断的技术飞跃。
临床疾病诊断：
各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。
禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。
食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。
医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。
各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。
标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得CT值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
标本载体
0.2ml薄壁PCR离心管
标本数量
标本数量36个，包括4个标准品
试 剂
SYBR Green I，FAM，Tex Red，FITC等荧光染料，开放式PCR试剂
反应体系
10-100μL
建议质控
四个阳性标准品、阴性对照
指标
荧光激发波长
470nm
荧光发射波长
530nm，640nm，710nm
570nm，605nm
荧光检测方式
光开关阵列组合光电倍增管PMT方式
控温范围
4.0℃-99.0℃
热盖温度
100℃～120℃
升/降温速度
≥4.0℃/S（Max）
温度均匀性
≤±0.3℃
温度度
≤±0.3℃
温度显示精度
0.1℃
检测范围
101～1010DNA/RNA copy/ml
CT值重复性误差
CV≤2.1％
核酸精度相关系数
R≥0.997
温阶
1～9
循环
1～99
保温时间
1～9999秒
文件
1～9个连接
升级方式
远程硬件内控软件升级
系统接口
RS-232C串行接口，双向数据
Windows2000/XP
产品外形尺寸
50cm × 40cm × 35cm
产品重量
25kg
使用环境
温度5～40℃，相对湿度≤80％
使用电源
AC220 × （1±10%）V,50 × （1±2%）HZ
功耗
1100VA
多规格
提供96孔，多通道/多色、36孔等不同规格产品
技术应用实现快速均衡扩增检测由光开关阵列、自聚焦透镜和尾纤准直器及变增益微光O/E装置组成的MEMS有机整体，在以16位单片机为核心的电控装置管理下，能在毫秒级时间内完成多个标本快速均衡扫描检测，避免了机械扫描方式或CCD扫描方式引起的时间滞后或渐晕误差。实现标准样本的PCR热循环扩增及高通量实时荧光激发和定量检测。
产品突出特性
« 走在PCR技术的前列
在PCR仪和市场化领域中历史悠久；
将标准化的PCR检测技术成功广泛用于临床；
« 快速实时PCR技术实现了DNA/mRNA检测的快速性
实时检测启用荧光探针标记特定核酸的方法使准确性更高；
简化了传统PCR方法；
使用zui少的样本量，在一小时左右出结果；
« 简便闭管分析使您完成加样后就无须再接触样本
减少样本消耗殆尽风险；
缩短了出报告时间；
简化了试验步骤；
« 提高了用户应用的灵活性
提供了用户自定义PCR操作平台；
建立您的用户自定义应用；
分析用户自定义试验；
« 高性能
高灵敏度；
高特异性；
宽的动态范围；
« 强大的软件数据管理系统
完整的病例档案；
集成化的网络服务功能；
图标显示；
自动试剂及结果跟踪；
客户使用界面友好；
« 开放式、个性化仪器易于适应您的实验室环境
« 免维护光源系统
高亮度窄带LED光源，工作稳定，使用寿命长，终身免维护
« 灵敏的光电系统
荧光激发/检测单色器采用美国原产滤光片；检测器采用日本原产金属封装式光电倍增管PMT，具有灵敏度高、快速、稳定的特点；准直器、光开光阵列、光纤组件、电控装置全部采用进口期间；精度高，一致性好。
« 先进的温控系统
本仪器采用膜加热及半导体热泵制冷技术保证了升降温的快速稳定、仪器寿命长的特点，加有热盖保证了PCR无矿物油操作，避免了人为原因造成的污染。
« 先进的温控系统
本仪器采用膜加热及半导体泵制冷技术保证了升降温的快速稳定、仪器寿命长的特点，加有热盖保证了PCR无矿物油操作，避免了人为原因造成的污染。
« 友好的软件系统
中文Windows传统界面更符合国人操作习惯，多个标准参数填空式输入降低了因参数设置所造成的事物；参数输入提示保证了参数输入的有效性。
« 多样化的运行方式
每个程序段数多达9个；每个程序的步骤多达9个；每个程序的循环数多达99个，温度、循环等多个参数的多种修正、调节方式，可*临床及科研上试验的要求。
« 良好的线性范围、灵敏度、重复性
线性范围广、可检测的样品浓度线性范围101～1010，灵敏度zui小分辨率为1拷贝，重复性CV≤2.1%。
« *的瞬时断电保护功能
瞬时停电后本仪器可提醒用户继续试验。因电网或其他或其他原因造成的短暂瞬时停电不再会给您的实验带来麻烦，为您减少试剂的损耗，解除您PCR实验室没有专线电源的顾虑。
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