蛋白质的分离纯化方法
沉淀法：原理：是使蛋白质胶体颗粒的表面水化膜或表面电荷破坏，从而使蛋白质沉淀。
• 盐析法
• 有机溶剂沉淀法
• 等点电沉淀法
• 选择性变性沉淀法
• 聚合物沉淀法
在生物大分子制备中zui常用的几种沉淀方法是：
• 中性盐沉淀（盐析法）：zui大的特点是环境温和，不易造成蛋白质变性。因此适用于各种蛋白质和酶的分离纯化。缺点是分辨率底，且后续处理时需要除盐。
• 有机溶剂沉淀：分辨率高于盐析法，但容易引起目的蛋白失活。所以多用于生物小分子的分离纯化比如多肽、寡肽。
• 等电点沉淀：其局限是，须事先了解蛋白的PI；且沉淀过程中可能发生变性和失活，部分蛋白等电点沉淀后不容易溶解，因此较少用于目的蛋白的沉淀。用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。
• 选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。三氯yi醚是比较常用的酸变性剂，尤其在分析样品的浓缩而不需考虑活性的条件下用得多。
• 有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇作为沉淀剂，常用PEG6000和20000。它条件温和，不易变性，且沉淀效果强，很少量的PEG可沉淀大量的蛋白。缺点是PEG除去比较困难。
根据分子大小不同：超滤法、透析法（膜分离法）、超速离心法、 凝胶过滤法（GF）也称大小排阻层析，是一种根据分子的大小和形状来进行分离的方法。不同的蛋白质分子通过凝胶微孔时因迁移能力不同而被分离。利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，（在其分离范围内）按分子大小将样品中各组份分离开来。大分子先被洗脱，小分子后被洗脱。应用：脱盐 Sephadex G10、25，中间纯化 Sephadex G200，精纯 Sephacryl 、Superdex。常用填料：Sephadex系：是以氯代环氧丙烷进行交联的葡聚糖珠状凝胶，经典的凝胶介质。Sepharose系:经过纯化的琼脂糖，含极少的带电集团。型号zui多、应用zui广。Sephacryl系：有是丙基葡聚糖与N,N’-亚甲基双丙稀酰胺共聚而成，经济。Superdex系：是葡聚糖与琼脂糖共聚而成的复合凝胶，，选择性强，分辨率*。
• 凝胶类型：葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
• 葡聚糖凝胶：直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成。
凝胶回收处理方法：将样品*洗脱下来后，继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶后，将柱下口放在小烧杯中，慢慢打开，再将上口慢慢松开，使凝胶全部回收至小烧杯中，备用。
G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也代表特水量。X数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。X数字也代表凝胶的持水量，如G-25表示1g干胶持水2.5mL，G-100表示 1g干胶持水10mL，依次类推。葡聚糖凝胶和生物胶多以干粉形式保存，使用前需用水或洗脱缓冲液充分溶账。在室温下让其充分溶账胀达到平衡，通常需要较长时间。较快的做法是将干胶往水里加，边加边搅，以防凝胶结块，然后放到沸水浴中加热接近100℃，几个小时就可以使其溶胀，还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一般用3～5倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。新装好的柱要检验其均匀性－可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。也可以对光检查，看其是否均匀或有无气泡存在。
蛋白质的分离纯化方法
凝胶用过后，有几种保存方法：
湿态保存：在水相中加防腐剂，或水洗到中性，高压灭菌封存（或低温存放）；
湿态保存：在水相中加防腐剂，或水洗到中性，高压灭菌封存（或低温存放）；
干燥保存：水洗后滤干，依次用50％、70％、90％、95％乙醇脱水，再用乙醚洗去乙醇，干燥（或60～80℃烘干）后保存。加乙醇时，切忌一上来就用浓乙醇处理，以防结块
对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子量都大于5000D，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。所以常选用Sephadex G-25凝胶作为分离固定相，因为它的分离范围是1000～5000D。被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其Kd值的差可达zui大值1。对于分子量小于5000D的肽类进行脱盐操作则常选用Sephadex G-15凝胶。
另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。下面以zui常用的葡聚糖凝胶类为例，分别加以讨论 。
葡聚糖凝胶离子交换剂使用方法
新购进的阳离子交换剂（如CM-Sephadex C-25）为Na型，阴离子凝胶交换剂（如DEAE-Sephadex A-25）为Cl-型，使用前要按一般离子交换剂的使用方法进行转型处理。1g阴离子交换剂约用100mL,0.5mo1/L NaoH溶液浸泡20min后减压过滤，充分洗涤，再用等量0.5mol／L HCL处理，洗至中和备用。阳离子交换剂lg约用100mL 0.5mol／L HCL浸泡20min后过滤，充分洗涤，再用等量0.5mo1／L NaOH溶液处理20min，洗至中性备用。将以上处理好的葡聚糖凝胶离子交换剂，用20～30倍量与层析时所用的同种缓冲液浸泡（但浓度要高，如0.1～0.5mol／L），再用同种酸或碱调节至所需要pH值，放置1h后，待pH值不变即可减压过滤。
| 型号 | 分离范围Da | 粒径 | 建议流速cm/h |
| Sepharose 2B | 70-40,000 | 60-200 | 10 |
| Sepharose 4B | 60-20,000 | 45-165 | 11.5 |
| Sepharose 6B | 10-40,000 | 45-165 | 14 |
| Sepharose CL-2B | 70-40,000 | 25-75 | 15 |
| Sepharose CL-4B | 60-20,000 | 25-75 | 26 |
| Sepharose CL-6B | 10-40,000 | 25-75 | 30 |
| Sepharose 6 | 5-5,000 | 20-40 | 30 |
| Sepharose 12 | 1-300 | 20-40 | 30 |
| Sepharose FF 6 | 10-4,000 | 平均90 | 300 |
| Sepharose FF 4 | 60-20,000 | 平均90 | 250 |
• 根据分子所带电荷差异电泳法、等电聚焦等。离子交换层析法（IEX）：原理：首先是根据蛋白质的带电类型（阳离子或阴离子），然后根据其相对电荷强度进行分离。PH：阴离子交换层析：蛋白质带负电荷，则要求PH>PI，但不能高于介质功能基团的PK；阳离子交换层析：蛋白质带正电荷，则要求PH<PI，但不能低于介质功能基团的PK；缓冲溶液：阴离子交换层析：Tris-HCl 阳离子交换层析：PB。带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。阳离子交换剂 — 带负电荷，与阳离子交换；阴离子交换剂 — 带正电荷，与阴离子交换。
常见问题分析：
不吸附：缓冲溶液PH不对；离子强度太高；
峰形不稳或出现奇异峰：柱床中有气泡或缓冲溶液不纯
分辨率低：梯度太大；流速太高
前沿峰：柱过载；填充效果差；柱需再生
峰拖尾：样品在柱滤膜上或凝胶床顶部沉淀
基线随梯度上移：盐浓度临近CMC
1.离子交换树脂
2.离子交换纤维素
§ 阴离子交换纤维素 —如:DEAE-纤维素 pH8.6以下分离中性或酸性物质,具二乙胺乙基
§ 阳离子交换纤维素—如:CM-纤维素 一般pH>4条件下使用,具有羧甲基
3.离子交换凝胶— 分离大分子物质
离子交换剂的选择考虑因素：
1.被分离物质带何种电荷
2.被分离物质分子的大小
大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素
3.被分离物质所处的环境
4.被分离物质的物理化学性质
5.被分离物质的大概数量
根据疏水性不同：疏水层析（HIC）、反相色谱（RPC）： 原理：是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子迁移速度快而先被洗脱下来。一般使用甲醇、乙腈作流动相，使得蛋白质容易变性失活；常用于HPLC分析，与在水-有机相中稳定的多肽和低分子量蛋白质的分离。
蛋白质的分离纯化方法
梯度淋洗装置
外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。
内梯度:一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。
示差折光检测器：可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；
亲和层析（AC）：
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