细胞凋亡检测方法在肿瘤研究中的应用
细胞凋亡的细胞化学测定

细胞凋亡的细胞化学测定包括细胞表面（细胞膜）的结构和通透性改变的测定和细胞核DNA改变的测定。根据应用的范围，又可分为细胞群休和单个细胞测定两种，以下仅介绍其中几种较为常用的方法。

碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测

早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入zui终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。

细胞凋亡检测方法在肿瘤研究中的应用
检测方法：获取11×106细胞/ml的细胞悬液，先用PI染色，再行Hoechest3342染色，进行流式细胞仪分析或荧光显微镜观察。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外线激发，前者荧光为红色（620nm）,后者荧光为蓝色（480nm）。正常细胞蓝色zui强。早期凋亡细胞由于DNA的漏出蓝色稍弱并有少量的红色荧光，晚期凋亡细胞红色荧光加强。坏死细胞红色荧光zui强。

膜联蛋白（annexin）V标记

正常细胞的细胞膜磷脂分布是不对称的，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）位于细胞膜内侧，在细胞凋亡时转至细胞膜外表面，这一改变被认为是特导性的，并且可作为凋亡细胞表面改变的标记。PS表面化发生于凋早期，其机制尚不清，可能是一种导致机体吞噬凋亡细胞的信号。膜联蛋白V是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力，荧光标记的膜联蛋白V与细胞表现PS结合，再用显微镜或流式细胞仪进行检测，可以观察凋亡过程中细胞膜PS的表面化。结合PI染色进行双参数检测尚能区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。正常细胞膜联蛋白V（-）PI（-），早期凋亡细胞膜联蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡细胞和坏死细胞膜联蛋白V（+）PI（+）。有研究表明膜联蛋白V标记仅有不到三分之一的凋亡细胞出现阳性标记，其原因尚不明。同时需注意度的是凋亡后期溶解阶段，细胞碎片也可出现明显的阳性着色。

检测方法：1×106细胞/ml细胞悬液，先后用膜联蛋白V--FITC及PI染色，流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的细胞直方图（cytogram），每个象限的细胞数目就是在检测细胞总数在所点的组份。左下象限代表正常细胞（An-PI-）,右下象限代表早期凋亡细胞（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞（An+PI+）,左上象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞（An-PI+）。用生物素标记膜联蛋白V还可以作体内试验。将生物素标记膜联蛋白V注射小鼠体内，30分钟后处死，迅速取出要研究的组织置于甲醛内固定，然后，常规石蜡切片，脱蜡、水化，用亲和素标记的过氧化物酶程程序孵育，DAB显色，光镜下观察凋亡细胞。

DNA琼脂凝胶电泳法

细胞凋亡时，在内源性核酸内切酶的作用下，DNA在核小体间被切割成180-200bp整数倍的单或寡核苷酸片段，在电泳时表现为特征性的“梯形带”。自Wyllie把内源性核酸内切酶降解产生“梯形带”与细胞凋亡相以来，“梯形带”被作为细胞凋亡的一个重要的生化指标。尽管有报道指出，实验中出现典型的形态改变时可不伴有核小体间的DNA降解，对这一指标提出质疑，本方法仍被广泛应用。但此方法敏感性不高，大量凋亡细胞同时存在时才出现典型的结果，且只能被用于细胞群体，不能用于组织的原位检测。

检测方法：培养细胞清洗、离心，加入细胞裂解液裂解，高速离心，取上清液用酚/氯仿抽提二次，RNA酶消化，然后加到含溴已锭的1％-2％的琼脂糖凝胶的样品的孔中进行电泳，zui后在紫外线灯下观察和摄影。

DNA裂解的原位检测

在细胞水平检测DNA裂解的原位标记技术已越来越多地被用于组织切片和培养细胞，细胞凋亡时，由于DNA的裂解，形成单或寡核小体的双链相对分子质量小的片段及在相对分子质量大的DNA上形成单的继裂（缺口，nick）。此类断裂可用生物素、地高辛或荧光素标记的核苷酸在3`-OH端予以显示。通常采用的酶是DNA聚合酶I或未端脱氧核苷酸转移酶（TdT），前者使核苷酸结合于缺口，需要模板存在，标记方法通常被称为“原位缺口平移”（insitu nick translation,ISNT）,后者使核苷酸在双链的断端延伸，不需要模板的存在，其方法被称为未端记（end labeling）、加尾法（tailing reaction）或TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）。上述方法，尤其是TUNEL的应用已很广泛，其优点是可用于原位标记，可用于病理组织，并可进行定量分析。值得注意的是坏死期由于内源性核酸内切酶和蛋白质酶的何等用，DNA被切割成大小不等的片段，也可出现 阳性反应。组织或细胞外理不当时可出现假阳性。因而，TUNEL等方法对凋亡细胞的标记是选择性的。而不是特异性的，TUNEL或其他DNA裂解原位标记的分析应结合阳性细胞的形态，尤其是核的特征，细胞的分布和有无炎症反应，除外非凋亡的阳性反应。

检测方法：石蜡切片常规脱蜡、水化，蛋白质酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育，显色（辣根过氧化物酶标记可用DAB显色，碱性磷酸酶标可用NBT+BCIP显色），复染，脱水，封片。凋亡细胞核呈现蓝色（NBT+BCIP显色）或者棕黄色（DAB显色）。

凋亡蛋白质酶（Caspase）-3及其底物的检测

凋亡蛋白质酶是一类半胱氨酸蛋白质酶，具有特异性水解底物分子天冬氨酸（Asp）残七C端肽键功能，是近年随着调亡研究的深入而发现的重要凋亡分子。迄今已有13个分子得到命名，分别为凋亡蛋白质酶1-13。基中凋亡蛋白质-3是被认为在多种组织、细胞类型中zui常涉及的凋亡效应分子。活化的凋亡蛋白质酶-3仅在凋亡细胞中发现，因此，检测凋亡蛋白质酶-3的活性有助于发现早期的凋亡细胞。一般采用人工合成四肽荧光底物如DEVD-AMC，凋亡蛋白质酶-3在D与AMC之间水解，释放荧光物质、AMC，后者在紫外线激发下发出波长为430-460nm的荧光，通过流式细胞仪或分光光度计对其强度进行定量，从而测定凋亡蛋白质酶-3的活性。由于醛对凋亡蛋白质酶-3的水解活性抑制作用，因此同时加入含醛四肽如DEVD-CHO可以抑制凋亡蛋白质酶-3对DEVD-AMC的水解，不产生荧光。这样的抑制试验可作为对照，使凋亡蛋白质酶-3的活性分析更有特异性。但是，上述方法不适用于组只切片，因此有人尝试采用针对活化的凋亡蛋白质酶-3亚基的抗体，通过免疫组化显示凋亡细胞，然而其敏感性及特异性尚不能令人满意。

检测方法：培养细胞（也可以预先作凋亡诱导并在不同时段收集细胞）在裂解液内裂解、离心、去上清液。加入凋亡蛋白质酶-3的底物（如DEVD-AMC）孵育，同时用不加底物的样品作对照，流式细胞仪检测，加有底物的样品释放出的荧光强度样对照样品明显增强。如加入DEVD-AMC时再加入DEVD-CHO，样品释放的荧光强度与对照样品无差异。

细胞凋亡检测方法在肿瘤研究中的应用
凋亡蛋白质酶-3导致细胞凋良心是通过水解或灭活一些细胞关键蛋白质实现的，因此检测凋亡蛋白质酶-3底物的改变也有助于辨认细胞的凋亡。PARP是*个被认识的凋亡蛋白质酶-3底物，它的相对分子质量为116000，水解后形成相对分子质量为85000及相对分子质量为25000的两个片段，用运载相对分子质量为85000片段的抗体可以观察细胞是否发生凋亡。细胞骨架蛋白中的CK-18被凋亡蛋白质酶-3水解后，在其C端的第387-396位氨基酸残基形成一个新的抗原表位，用抗此表位的抗体可以在组织切片上辨认凋亡细胞。另外一种细胞骨架蛋白质肌动蛋白（actin）被水解后产生一种称为“fractin”的片段，在凋亡早期出现，并认为与细胞膜的起泡有关，可能有助于早期凋亡细胞的辨认。总之，随着对凋亡蛋白质酶及其底物的进一步研究，将会发现更有价值的有助于检测凋亡细胞的方法。