肿瘤细胞培养基反复贴壁法和机械刮除法步骤

    根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。

　　（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks 冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；

　　（2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养基液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许*培养液置温箱中继续培养；

　　（3）培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加*培养基。

　　当三个瓶内都含有培养基液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。 

    是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为：

　　（1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；

　　（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；

　　（3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；

　　（4）注入培养基液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至*除掉为止。