金鱼相关蛋白（AGRP）试剂盒使用原理

使用目的：本金鱼相关蛋白AGRP试剂盒用于测定金鱼血清、血浆及相关液体样本中Agouti 相关蛋白（AGRP）含量。

实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中金鱼相关蛋白AGRP水平。用纯化的金鱼Agouti 相关蛋白（AGRP）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入Agouti 相关蛋白（AGRP），再与HRP 标记的Agouti 相关蛋白（AGRP）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的Agouti 相关蛋白（AGRP）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中金鱼Agouti 相关蛋白（AGRP）浓度。

金鱼相关蛋白AGRP试剂盒组成
1 30 倍浓缩洗涤液 20ml×1 瓶 7 终止液 6ml×1 瓶
2 酶标试剂 6ml×1 瓶 8 标准品（80ng/L） 0.5ml×1 瓶
3 酶标包被板 12 孔×8 条 9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶
4 样品稀释液 6ml×1 瓶 10 说明书 1 份
5 显色剂A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 张
6 显色剂B 液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 个

标本要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤
1. 标准品的稀释：本金鱼相关蛋白AGRP试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
40 ng/L 5 号标准品 150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液
20 ng/L 4 号标准品 150μl 的5 号标准品加入150μl 标准品稀释液
10 ng/L 3 号标准品 150μl 的4 号标准品加入150μl 标准品稀释液
5.0 ng/L 2 号标准品 150μl 的3 号标准品加入150μl 标准品稀释液
2.5 ng/L 1 号标准品 150μl 的2 号标准品加入150μl 标准品稀释液
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。
4. 配液：将30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：金鱼相关蛋白AGRP每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 分钟.
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止液后15 分钟以内进行。

操作程序总结：
计算
以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。