Percoll细胞分离液,适合分离细胞,亚细胞成分和大病毒(>70S),渗透压均匀,粘度低,可调至生理离子强度和pH,分离条件温和,对细胞无毒性,可以灭菌消毒。
1 作用原理
Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm/kg H2O), 粘度也很小,可形成高达1.3g/ml密度,采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200~1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低,所形成的梯度十分稳定。此外,Percoll不穿透生物膜,对细胞无毒害,因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒,还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
2 分离液的配置
将1份10XPBS与9份Percoll贮存液混合,制成等渗Percoll悬液,此悬液被认为是100%Percoll悬液,其密度为1.1294g/ml。用PBS或细胞培养液稀释100%Percoll而获得所需密度的Percoll分离液用于相应细胞的分离。若分离淋巴细胞应使用1.0777g/ml,配制时用稀释液稀释60%即可。
取比重1.077的Percoll分离液X ml与离心管中,将等倍稀释的抗凝血1/2 X ml 小心叠加在分离液上,经水平离心(1500rpm)后,便得四个细胞层,从而分离出淋巴细胞。表层为死细胞残片和血小板,底层为粒细胞和红细胞,中间有两层,上层富含单核细胞,下层富含淋巴细胞。
3 分离液的优点
该法是纯化淋巴细胞和单核细胞的一种较好的方法,淋巴细胞纯度高达98%,单核细胞纯度可达78%。
因为Percoll具有渗透性低、不穿透细胞、粘度低、密度高和无毒害等优点,与目前常用的密度梯度离心介质,包括蔗糖(Sucrose)、血清白蛋白(Serum albumin, ALB)、聚蔗糖(Ficoll)、氯化铯(CsCl)等相比,是目前较理想的介质。Percoll密度梯度离心已被多次成功地用于动物细胞及其细胞器的分离,纯化了包括人血液细胞、骨髓细胞、红血球细胞、白血球细胞、淋巴细胞、肝细胞等在内的十余种动物细胞。这一技术也开始用于用于分离和纯化植物原生质体、核、叶绿体和线粒体。