双抗体夹心法检测抗原

    双抗体夹心法用于检测抗原。它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比。

实验步骤

1．用包被液稀释包被抗体至合适浓度，包被酶联板，每孔100μL。也可37℃，2小时包被，但此方法不建议使用。包被抗体即可以是单抗，也可以是多抗。但抗体的包被浓度应当通过预实验确定。包被的板条可以在4℃保存数月。

2．每孔加入100ul洗涤缓冲液，清洗酶联板3-5次。

3．10%小牛血清封闭，每孔200μL，湿盒中37℃封闭1小时。也可以用1.5%酪蛋白或者0.25%的BSA封闭。

4．每孔加入100ul洗涤缓冲液，清洗酶联板3-5次。zui后一次在吸水纸上扣干。

5．加标准样品及样本。

（1）标准曲线：用1×PBS稀释标准品分别至1000ng/ml、500ng/ml、250 ng/ml、125 ng/ml、62.5 ng/ml、31.25 ng/ml、15.625 ng/ml、7.18 ng/ml。

（2）待测样品：用1×PBS稀释（不同样品的稀释倍数不同，一般稀释原则为稀释后的样品浓度应在标准曲线之内）。

（3）以上下做平行孔，前两孔作空白加入1×PBS，其余依次加入标准曲线、待测样品。加入体积每孔100ul。湿盒中37℃反应1小时。

抗原抗体反应比较快，一般1~2小时就达到峰值。延长反应时间容易出现非特异结合。

6．每孔加入100ul洗涤缓冲液，清洗酶联板3-5次。zui后一次在吸水纸上扣干。

7．加酶标二抗，根据抗体使用说明用1×PBS稀释，每孔100ul湿盒中室温反应40分钟。

二抗的使用浓度应当进行预实验确定，二抗的反应时间不能过长，容易出现非特异反应。

8．每孔加入100ul洗涤缓冲液，清洗酶联板3-5次。zui后一次在吸水纸上扣干。

9．加底物显色液：称取OPD（邻苯二胺）4mg用10ml底物缓冲液充分溶解，加入15ul H202每孔100ul闭光反应5分钟。OPD要充分溶解，否则容易出现个别孔颜色太深。

10．终止液终止反应每孔100ul终止液。

11．酶联免疫检测仪492nm读数。

12．以测定的OD值绘制线性回归标准曲线，以标准品蛋白浓度LN值为横坐标，相应的OD值为纵坐标，绘制出一条标准曲线并添加线性回归趋势线，其相关系数R2应大于0.95，根据方程计算出样品中的目标蛋白含量。抗体