抗肿瘤药物敏感性检测实验方法繁多，大体上分为体内和体外两类方法。各种方法各有其优点和局限性，使用某一种方法难以确定药物抗癌作用，应根据实际情况选择适当的方法。本章分别介绍体外抗肿瘤药物敏感试验及体内抗肿瘤药物敏感试验。其中，体外抗肿瘤药物敏感试验包括四噻唑蓝法药物敏感试验、致死细胞染色法药敏试验、3 H—TdR掺人法药物敏感试验、染料排斥试验法、生长曲线测定法、集落形成试验法和三磷酸腺苷生物发光法。体内抗肿瘤药物敏感试验包括裸鼠移植瘤试验和小鼠肾包膜下肿瘤移植试验。

    肿瘤患者常因肿瘤病因和类型不同以及个体差异的原因，对化疗药物的敏感性有很大差异。为了减少临床选择化疗药物的盲目性，实行个体化治疗，化疗前预测肿瘤细胞对化疗药物的敏感性至为重要。肿瘤细胞化疗药物敏感性的主要指标是细胞数量的增减。但是这一指标不能显示细胞的死亡和存活方面的信息，而用活细胞数量的增减来表达肿瘤细胞对化疗药物敏感性更为恰当。目前检测肿瘤细胞存活状况的主要方法为台盼蓝拒染法、四噻唑蓝(methvlthiazolete trazoliunl，MTT)法和放射性同位素掺人法。台盼蓝拒染法由于其指标判断人为因素较多，较少应用。而MTT法能客观、准确地反映细胞的存活状态，故较常应用。

(一)四噻唑蓝法药物敏感试验

1．试验原理在正常情况下，细胞线粒体进行三羧酸循环过程中，琥珀酸脱氢酶能催化琥珀酸脱氢，并氧化成延胡索酸；而MTT可接受脱下来的H+ ，使可溶性的黄色MTT变成难溶性、紫蓝色的沉淀，并沉积在细胞中，而死的细胞则无此功能。再用DMSO溶解萦色的沉淀，在酶标仪下测定其吸光度A值，即可计算出存活细胞数。该方法具有快捷、方便、灵敏、经济的特点，并与临床治疗有较好的一致性。MTT快速比色法已被推荐为抗癌药物的筛选方法。

2．材料

(1)待检药物：待测定的化疗药物。

(2)细胞：临床肿瘤细胞的主要来源是由外科手术获取。将切下的肿瘤组织立即放人装有培养液的无菌冻存管中，4℃保存，12h内使用。也可以是体外培养的细胞株。

(3)试剂：MTT(用pH7．2～7．4的PBS现用现配成5mg／ml MTT，或配好后避光4℃储存，备用l周)、含10％CS的RPMI 1640培养液(内含100 U／ml青霉素和100μg/ml链霉素)、Halaks液、DMSO、O．1％胶原蛋白酶、O．25％胰蛋白酶一O．02％EDTA、HBSS。

(4)器材：无菌的96孔培养板、手术剪、100目和200目不锈钢网、培养皿、离心管、加样枪及枪头、酶标仪等。

3．实验方法

(1)无菌条件下剔除坏死及非肿瘤组织，用Hanks液冲洗1次。

(2)用下述方法之一将肿瘤组织分散为单细胞：

1)机械分散法：充分剪碎肿瘤组织，经100目和200目不锈钢网挤压过滤，收集细胞。

2)酶消化分散法：充分剪碎肿瘤组织，首先经o．1％胶原蛋白酶37℃下消化20min，再用O．25％胰蛋白酶一O．02％EDTA混合液(1：1)37℃下消化，收集细胞。

(3)将分散的细胞悬液加入含100％和75％淋巴细胞分离液的梯度离心管中，2000r／min离心20min，吸取zui上层(75％分离液的界面上)的肿瘤细胞。

(4)用Hanks液离心洗涤2次，弃上清液，加入适量培养液重新悬浮细胞。

(5)立即将肿瘤细胞悬液以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板(200μl／孔)，同时加入事先确定浓度梯度的各组抗癌药10μl／孔(对照组加入培养液10μl／孔)。在37℃、5％CO2孵箱中培养48～72h(培养时间取决于实验的目的和要求)。

(6)每孔加入MTT(5mg／m1)20μl，37℃作用4h。

(7)小心吸弃各孔内的上清液，对于悬浮生长的细胞需1000r／min离心5min，然后再吸弃上清液。每孔加入DMSO 150μl，振荡，使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在波长450～600nm处测定吸光度A值。

(8)各药物浓度组设3个平行孔，实验重复3次，取平均值计算药物作用后肿瘤细胞生长抑制率。

4．结果分析若实验组的细胞生长抑制率大于50％，即表明药物有效。