(一)形态学鉴定

1．光学显微镜检查

(1)培养瓶(皿)或培养板直接置于倒置显微镜下观察，上皮细胞呈多边形，边界清晰，大小规则，核呈圆形，核质比例小，细胞间排列整齐，为单层培养物，无重叠生长，是正常上皮组织来源；成纤维细胞呈长梭形，核小而圆，细胞排列规则、整齐，为单层培养物，无重叠生长，是正常间质组织来源。肿瘤组织来源的贴壁细胞，其单层培养物呈多层重叠生长。

(2)细胞染色检查：将无菌小玻片(O．5cm×2cm)于细胞传代接种前放人培养瓶皿内，接种细胞悬液后培养，在玻片上制备培养的单层细胞，然后将载有细胞的玻片取出，用磷酸盐缓冲液(phosphate-buffeer saline，PBS)轻轻漂洗后，将玻片放在普通玻片上，空气中自然干燥。经PBS／甲醇(1：1)固定液同定15min，弃固定液，加吉姆萨(Giemsa)染色液染色10～15min，用清水漂洗干净，置于空气中干燥，用二甲苯透明，用光学树脂胶片封片后观察。上皮细胞和成纤维细胞的形态与直接镜检相同，细胞核染成紫红或蓝紫色，胞质染成粉红色。

2．电子显微镜观察通常用透射电镜检查细胞的超微结构。取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化，加培养液悬浮消化的细胞，用1000r／min离心5min。收集离心管底部细胞，经戊二醛固定，包埋，超薄切片；也可采用细胞原位包埋的方法，将细胞培养于电镜用特殊膜上，进行固定，包埋，该法不破坏细胞问排列关系。在电镜下可见到上皮细胞的张力原纤维和桥粒等，腺细胞可见胞质中的分泌颗粒，这对确定培养细胞系组织来源有重要意义。

(二)细胞核型分析

    细胞染色体核型分析能简易、有效地确定细胞种来源和鉴定正常或恶性的性质，以及检查细胞有无交叉污染等。细胞染色体核型分析包括制备中期细胞分裂象样本，将分散的单个染色体进行计数和排列分组分析。

1．制备细胞分裂样本取对数生长期的细胞悬液，加入1×1 0-5 mol／L秋水仙素(终浓度为1×10-7mol／L)到养液中，处理6h后，轻轻吸出培养液，加0．25％胰蛋白酶消化细胞或手振摇培养瓶使细胞脱落，收集中期分裂象细胞，37℃静置20min后加入冰醋酸一甲醇(1：1)1ml，固定细胞1～20min，再次以1000r／min离心：10min，去上清液，加入新固定液，吹打混匀，第3次经1000r／mln离心10min，收集分裂象细胞。

2．制备染色体玻片将沉集的细胞加入O．2ml醋酸甲醇分散细胞，取一滴细胞悬液加到冰冷的玻片上，同时用口吹散细胞液滴，使细胞均匀分散于玻片上。同时可多制备几张染色体玻片，待干燥后染色、镜检。

3．染色体计数及核型分析取染色体玻片经吉萨姆染色后镜检。在显微镜下可观察到多个中期分裂象细胞染色体，计数50～100个细胞染色体数目，并计数出细胞染色体的分布，细胞群体中分布zui多的染色体数目是染色体数。人正常细胞有46条染色体，为23对二倍体。染色体分组排列，每组染色体无增加或减少，无异常染色体。小鼠染色体为40条，不仅数目与人染色体不同，而且以顶端着丝点为主。人的染色体则为中央着丝点，数目与着丝点位置可作为细胞系是人或鼠来源的依据。

(三)细胞DNA指纹技术检测

    利用DNA指纹技术(DNA finger printing)检测细胞基因多态性，对于判断所建立的细胞系来源非常有用。细胞系的基因多态性应与其来源的个体基因相似，所以应保留原代组织或来源个体的血液作为对照样品。

1．制备细胞DNA的杂交膜

(1)用胰蛋白酶消化培养细胞，将消化的细胞用．PBS洗2～3次，1000r／min离心5min，收集细胞，提取细胞DNA，用紫外分光测DNA含量。DNA经EcoRI酶切，37℃处理，并取少量样品经琼脂糖电泳，应看到有大于5kb的DNA条带出现。

(2)将酶切处理的DNA加入6×上样缓冲液混匀，上样到分析胶上，同时应有其他已知细胞系的酶切DNA为对照，以及与分子量标准标志物一起电泳(3V／cm)，直到分子量际准HindⅢ酶切*片段(23kb)已泳动出一定距离(电泳17～20h)，在紫外灯下照相记录。

(3)分析胶变性后进行Southern印迹杂交分析。将分析胶中的DNA电转移至硝酸纤维膜上，取出膜暴露于紫外线(302nm)下5min，然后放人干燥的杂交袋中保存，待杂交。

2．制备标记M13噬菌体探针

(1)放射性同位素标记M13：DNA取稀释的M13噬菌体2μl与1μ1无菌蒸馏水混合于离心管中，放人沸水中2min，再放冰上5min，然后加11．4μl的缓冲液和0．5μl牛血清白蛋白，加入10μl a一[32P]一dGTP、2μl Klenow酶，混合管中的内容物，短暂离心1次，放置温室。

(2)纯化M13 DNA探针：将放置的上述内容物吸出，加到已平衡好的葡聚糖(sephadex)柱内，上2×40μI过柱缓冲液，收集2次400μ1缓冲液的洗出液放人离心管内，作为探针。将放有探针的离心管放入沸水中2min，移至冰上冷却，待杂交用。

3．DNA杂交用标记好的M13探针与细胞DNA进行Southern印迹杂交分析。首先将转移膜放入预热的预杂交液袋中，置55℃振摇4h，然后移到预热的杂交液袋中，于55℃，同时加入探针进行杂交。次日将杂交后的转移膜置洗液中室温漂洗15min，共洗2次，再用预热55％含有O．1％SDS的洗液冲洗，于55℃振摇15min。zui后用1×SSC液洗膜，置滤纸上自然晾干。用放射性检测仪检查膜上存在的放射性同位素，进行放射自显影，冲洗x线胶片。

    自显影胶片上显示细胞DNA的电泳带型和组织来源细胞DNA对照的带型等，这对于鉴定细胞种的来源和组织来源提供了非常有用的证据，因为每个细胞系(除与组织来源的细胞)有*的带型。

(四)同工酶检查

    不同种系的细胞和同一种系不同组织之间同1二酶的表达呈多形性，酶功能虽相同，但结构各异，正常和肿瘤组织细胞之间的同工酶也不同，因此检测同工酶对于鉴定细胞系很有价值，常用于检测的同工酶有核苷酸磷酸酶(nucleoside phosphorylase)、葡萄糖6磷酸脱氢酶(glucose一6一phosphate dehydrogenase，G6PD)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase，MD)、乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase，LD)。

    同工酶的鉴定应先收集细胞，分别提取标准细胞、对照细胞及检测细胞的提取液，即*溶解上述细胞(细胞膜呈云雾状)，离心取上清液。制备凝胶，上样(细胞提取液)进行电泳，可用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶两种方法电泳。取下凝胶，同酶试剂反应，即针对不同酶加入相应的底物显色，进行检测。检测细胞系的同工酶谱具有特异的带型．与原取材组织相同，但与对照细胞、标准细胞比较，即可区分出人和鼠等种系的细胞来源。

(五)抗原标记

    细胞表面抗原可作为鉴定细胞来源的重要标志物，如上皮细胞表面特异性抗原可与正常上皮细胞荧光抗体结合，在荧光显微镜下可见细胞表面出现荧光，作为正常上皮细胞的标志。也可用酶联免疫吸附试验(enzyme—linked immunosorhent assay，ELISA)检测。

(六)细胞生长实验

    正常细胞的生长与肿瘤细胞、转化细胞具有明显差别。正常细胞移植到裸鼠体内无浸润生长，不形成肿瘤；另外，在培养器皿中生长具有形成单层(具有接触性抑制)、饱和密度及停泊依赖等特点。