1.注意要点

（1）探针蛋白的本质与相互作用蛋白的来源：探针蛋白的本质：是全长蛋白、相互作用相关的结构域，甚至是化学合成的较小的生物活性片段。相互作用蛋白的来源：已知内源性表达探针蛋白的细胞系是寻找与其相互作用蛋白的理想实验材料。

（2）细胞裂解物的制备：成功制备细胞粗提物的关键因素包括：细胞的裂解方式；pH的控制；温度；避免蛋白的降解。这些都需要在预实验中多次重复来优化细胞裂解条件。提取重组蛋白有时不必破碎细胞。例如，许多高表达的哺乳细胞系（尤其是中国仓鼠卵巢细胞，CHO细胞）和酵母细胞株（如Pichiapastoris）已经被改造得可以分泌重组蛋白，因而可以直接从细胞条件培养基和培养滤出液中纯化重组蛋白。使用这些方法很重要的一点是要尽可能快地浓缩大量的细胞条件培养基，使之尽快进入“无蛋白酶的环境”。

2.疑难分析解答

（1）结合过程中的参数：发现和证实蛋白质的相互作用，与这些蛋白质在自然状态下相互作用的稳定程度密切相关。这种稳定程度决定了我们采用什么样的体外结合条件。在自然状态下那些参与细胞结构的蛋白质相互作用往往是极其稳定的，而在酶作用或蛋白转运过程中出现的蛋白质相互作用却短暂而不稳定。

    稳定的蛋白质相互作用能够在较长的时间中仍保持相互作用关系，是zui容易用GST沉降实验证实或发现的蛋白质相互作用。对于这些较强的蛋白质相互作用我们可以在较广泛的结合条件下都能够得到结果，往往我们常选用强离子浓度的缓冲体系避免非特异的蛋白质相互作用，从而降低假阳性的出现。如果蛋白复合体相互作用较弱，具有较高的解离常数，那么我们常通过pH、离子强度以及不同的缓冲体系来调整蛋白质的体外相互作用体系。

    用GST沉降实验来证实和探索自然中短暂而弱的蛋白质相互作用，则是一项较为困难的实验。这种蛋白质的相互作用往往很难用GST沉降实验类似的方法来完成。因为在实验过程这种蛋白质相互作用很可能就发生了解离。而这种短暂而弱的相互作用往往发生在酶发挥活性和蛋白质的转运过程中，在这些过程中常需要其他辅助因子的存在以及能量的参与（如NTP的水解产生的能量）。因此，要用GST沉降实验完成短暂而弱的蛋白质相互作用分析，就应该在反应体系中加入恰当的辅助因子以及能量，模拟一个和自然状态很接近的相互作用体系。

（2）蛋白复合物的洗脱

    在鉴定诱饵蛋白和靶蛋白过程中，需要将蛋白复合物从标签蛋白发挥亲和作用的基质上洗脱下来，SDS-PAGE的上样缓冲液和标签蛋白的竞争物都能够作为洗脱工作液。SDS-PAGE的上样缓冲液作为洗脱工作液往往具有更强的洗脱能力，但是也会导致蛋白复合物的变性。另外，上样缓冲液可以从基质上洗脱下能和亲和基质发生强相互作用的非特异结合蛋白质以及导致基质的脱落，这些都会影响后续的鉴定分析。而标签蛋白竞争性洗脱工作液，能够特异的洗脱下诱饵蛋白-靶蛋白复合物，而且还是一种非变性的洗脱方法，能够保持蛋白质复合体的自然空间状态，有利于某些随后的分析。

    另外一种洗脱方法能够选择的将靶蛋白洗脱下来，而保持诱饵蛋白仍和亲和基质相连。这种方法常采用步进式的增强盐离子浓度或降低pH。这种方法也是一种蛋白质非失活的洗脱方法，同时还能够提供蛋白质相互作用强弱的相关消息。细胞

（3）沉降实验中对照的设立

    在所有沉降实验中对照实验的设立都是必须的。在阴性对照实验中只加入亲和基质和靶蛋白混合液，而不加诱饵蛋白，从而能够帮助排除和亲和基质发生非特异结合的假阳性。在另一组阴性对照实验组中，只有亲和基质、诱饵蛋白和无靶蛋白的蛋白混合液，从而能够帮助排除和诱饵蛋白中的标签蛋白非特异结合的假阳性，这一组对照实验组也能够作为阳性对照，说明亲和基质能够有效的捕捉带标签的融合诱饵蛋白。