几种酵母转化方法
酵母转化原理:
像酿酒酵母,线性化的转化DNA和Pichiapastoris基因组的同源区域发生同源重组,使得线性化DNA产生稳定的转化子(Cregg et al., 1985; Cregg etal.,1989).这样的整合方式显示*的稳定性,即使多拷贝转化子在没有选择压力的情况下也很稳定.单交换事件(插入)比双交换事件(置换)发生几率更大.单插入事件中约发生1-10%概率的多插入事件.
电转化注意点:
一、 制备感受态的菌液收集时间:
1、准确测定OD值:OD在1.2~1.5之间。
1) 为了准确测定OD值,建议将菌液稀释不同浓度测定(1、2、4、8、16倍稀释,看其OD值是否呈线性关系)。每个倍数做3-5个重复,应该可以大致推断OD值是否准确!菌液看上去浑浊,但OD值不高,很可能OD稀释倍数不够!
2) OD值是否测准也可以这样估算:OD600为40左右时,菌体湿重(6000rpm离心5min)约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。
2、75ml的菌,经18h左右的培养,zui后sorbital洗涤完毕后,50ml离心管里所剩菌体特别浓,需要1mlsorbitol才可溶解为糊状。正常培养的OD在1.2~1.5之间的500ml菌液,收集的感受态也用1ml稀释的,没那么粘稠。可以看看降低培养温度(27摄氏度)或缩短培养时间(12h)。
3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50-100mlYPD中摇过夜,效果也很好
二、制备感受态的菌液量
如果只转一个样品,50ml就够了,一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的,其他的按比例缩小。用大试管摇5ml菌液,然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态,每一步的离心时间30秒就行。整个流程时间短,制备好的感受态用来做转化的效率很高。
山梨醇离心,洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度,不要过于粘稠和稀释。
三、感受态的保存
感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因,在冰上放几个小时再做可能有一定的影响,尽量马上制备马上转化。如果感受态细胞要保存,不需要加甘油,一般80ul EP管分装,-70 或 -80 摄氏度保存。
另附:酵母GS115点种分离纯化
接种GS115于5ml YPD液体培养基,30℃,200rpm振荡过夜,涂布 YPD平板,30℃培养48 小时,用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化,挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板,4℃保存。
四、电转化注意点:
1、感受态做好后,zui后一次吸出sorbital时,不是直接倒调的,而是用毛细管轻吸出来的,这样可能使剩下的感受态纯净些。
2、zui后用毛细管取出100ul出来,加入质粒,混匀!(怕量不够,吸得很多,电转时效果反而不好。 )
3、电转杯清洁处理:一般先冲洗,洗净;然后浸泡在75%的乙醇中;使用前我们都是放在超净台上,开启紫外,边吹风晾干,边进行紫外照射。电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。
4、电击的时候,电压数以及电击时间可以摸索一下,适当增加电压或者延长电击时间都可以。电击条件比如1.5kv,放电4.8~5.5ms。电击所有过程都要尽量在冰上进行,电击时间可以减少一点,设置为5ms左右,电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液,转移至EP管,30度静止培养1h。如果菌体悬液浓度比较大的时候,在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。
5、电击之后,加入1ml的山梨醇,吸入1.5ml的ep管中,置于30度摇床低速培养1h,再涂板。
6、注意的是处理液中的DTT是在使用前加入,其它配好后于4度保存,DTT单独于-20度保存,可配成100倍的贮备液。
7、转化后1ml用sorbitol重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上,按标准程序制作的感受态一般3块左右可能比较合适,以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。
五、转化试剂和培养基的正确准备方法
1、MD板子提前几天做好,放在冰箱里,涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子,可能吸收不是太好,板子上有些积层,反而不利于生长。
2、YNB42度水浴一会,然后过滤除菌,YNB是加到培养基里面的,去离子水pH偏低,建议直接用蒸馏水就可以(关系不是太大)。
3、山梨醇,以及无菌去离子水均是冰冻,存放在4度冰箱中
4、一般用10ug以上质粒用SalI酶切,然后直接加乙醇沉淀,70%乙醇洗一遍,约20ulddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT处理细胞,转化效率很高,可以试试。建议你不要用胶回收kit,回收的DNA可能还有盐,导致电击时放电时间很短。
5个电转化方案
方法一:
1.收集菌体
取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中,4℃、10000g 离心1min,弃上清,沉淀用无菌水(4℃)洗涤,同样条件下离心,弃上清。
2.菌体处理
加入1ml处理液,室温下放置20min。
处理液:
10mM LiAc
10mM DTT
0.6M sorbitol
10mM TrisHCl(pH7.5)
3.离心,弃上清,加入1ml 1M sorbitol ,离心,弃上清,
4.用1M sorbitol洗涤二次,到zui终体积约为80μl.(菌体太多可适当弃去部分)
5.加入10μl.经过BglⅡ酶切处理的工程质粒,混匀后转入 电击杯中,冰浴5min.
6.电转. 1.5kv,25μF,200Ω条件下进行电转。
7.电击后立刻加入1mL 1M sorbitol,吸出后于30℃培养2h。
8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin,涂布的量分别为100、200微升,剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上)
有一点要注意的是处理液中的DTT是在使用前加入,其它配好后于4度保存,DTT单独于-20度保存,可配成100倍的贮备液。
方法二:按下面步骤转化,开始每个板子只长了一二十菌落;小细节修改后,每个板长了约100个.
步骤如下:
1、目的DNA(pPIC9K),经电泳检测已经线性化(SalI酶切);
2、DNA纯化方法是经酚仿-氯仿两步抽提后,无水乙醇沉淀的,目测定量应足够;
3、GS115甘油菌经新鲜平板复苏后,5ML培养过夜,16h左右后,取菌1:100稀释,接种于70ml菌液扩大培养,14h后测得OD600约1.3左右。
4、将sorbital、水和菌液均冰浴;
5、菌液离心5min-100ml冰水洗涤-50ml冰水洗涤-4ml sorbital洗涤,然后溶解于300ul冰sorbital;
6、加入约5~10ug的DNA,枪吹匀,置0.2CM电转杯静置5min;
7、电击,1,5KV.
8、立即加入1ml冰浴的sorbital,静止10min。
9、取100ul转化液,涂布10cm的MD平板。
做了一点修改每块板子大概能长100来个菌落(一般需要2天左右):
1、菌液收集时间:以前可能是OD值测得不太准确,我然后把菌液分别做了1、2、4、8、16倍稀释,看其OD值是否呈线性关系。1、菌液测OD值时,建议将菌液稀释不同浓度测定,这样才准确些。菌液看上去浑浊,但OD值不高,很可能就是你的OD稀释倍数不够!你分别稀释2倍、4倍、8倍、10倍等,每个倍数做3-5个重复,应该可以大致推断OD值是否准确!
2、我开始是先挑单克隆于5mlYPD中,过夜16h后,转接于50mlYPD中,培养大概18个小时吧。OD值是否测准可以这样估算:OD600为40左右时,菌体湿重(6000rpm离心5min)约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。[测OD,用什么作空白对照呢?菌体稀释液,我一般使用PBS]
3、电击条件等上面帖子上都有,1.5kv,放电4.8~5.5ms。
2、其它做法相同,就是感受态做好后,zui后一次吸出sorbital时,不是直接倒调的,而是用毛细管轻吸出来的,这样可能使剩下的感受态纯净些。
3、zui后用毛细管取出100ul出来,加入质粒,混匀!(我以前怕量不够,吸得很多,电转时效果反而不好。 )
4、MD板子提前几天做好,放在冰箱里,涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子,可能吸收不是太好,板子上有些积层,反而不利于生长。
5、你说的YNB,我用的是成品,只需要直接配制。42度水浴一会,然后过滤除菌。我没有加硫酸铵。YNB是加到培养基里面的,去离子水pH偏低哦,我建议直接用蒸馏水就可以了(关系不是太大)。
方法三:简便*
在筛选高表达菌种中,与大多数人和说明书有区别(成功做出几个基因):
每次转化前,均用多种酶BlgII/salI/sacI同时切,转化时,用GS115/KM71/KM71H同时转化,转化的条件也和大家一样,即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子,不是0.2的,转化后涂MM及YPD+0.25G,长出菌落后,即进行大规模的表达试验,直接用YPD表达的,一般48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定,鉴定时,样品不用浓缩,直接上样,看到目的带后再做PCR,测序。
方法四:没有转化子(无aa的YNB和硫酸铵称好后,去离子水溶解,然后高压灭菌)
1.挑取酵母单菌落,接种至含有50ml YPD培养基的三角瓶中,30℃、250-300rpm培养过夜约14h,OD600约1.3
2.菌液离心5min-50ml冰水洗涤-25ml冰水洗涤-2ml sorbital洗涤,然后溶解于200ul冰sorbital;两管分装,每管100ul
3.加入约5~10ug的线性化的DNA20ul,枪吹匀,置0.2CM电转杯冰浴5min;
4.电击,1,5KV.使用的是 Eppendorf 2510,用于转化细菌及酵母。
5.立即加入1ml冰浴的sorbital,静止1h。
将菌体悬液涂布于MD平板上,每300µl涂布一块平板;
方法五: 和说明书差不多的方法
X33菌株于100ml YPD摇到OD600约1.1-1.3,太高影响感受态效率
(1) 1500-1700g离心5min,将离心管倒置在吸水纸上轻轻控几下,充分弃上清
(2) 加入100ml 冰浴的超纯水ddH2O,可在振荡器上振荡混匀,可静置3-5分钟
(3) 离心,弃上清,再加100ml ddH2O洗一遍
(4) 离心,弃上清,加20ml 冰浴1M Sorbitol洗一遍
(5) 离心,弃上清,菌体置于冰浴中,加入约100-200ul Sorbitol混匀
加入Sorbitol量需自己调整,这时菌液很浓,只要能够用200ul黄枪头吸出来就可以了,一般共有约400-500ul,够做几管感受态了。
(7) 吸取100-150ul感受态到线性化的DNA中,用枪头打匀或手指弹匀
静置5min,于2mm电转化杯中,电击参数:1.5KV,25uF,200欧姆(不是400),一般放电时间在4.5-4.9ms之间,小于4说明你的DNA盐浓度太高
(9) 立即加入1ml Sorbitol,转入10ml 离心管,30度静置1小时,然后加入1ml YPD,30度,200rpm摇1小时,取50-200ul菌液涂100ul/ml YPDS板
(10) 一般转化效率可以达到:200个以上转化子每200ul菌液,足够筛选表达菌株了。
方法六:酵母感受态细胞的制备
⑴ 接种Pichia pastoris GS115于5 ml YPD液体培养基,30℃,250~300250 rpm ,过夜。
⑵ 取200µl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的三角摇瓶中,28~30℃、250~300r/min培养过夜,一般12小时左右。
⑶ 将细胞培养物于4℃,5000g离心5min,用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬;
⑷ 按步骤3离心,用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬;
⑸ 按步骤3离心,用20ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬;
⑹ 按步骤3离心,用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬,其终体积约为2ml;
⑺ NOTE:可将其分装为200µl一份的包装冷冻起来,但如果保存时间过长会影响其转化效率。
化学转化
毕氏酵母氯化锂转化法
试剂
1. 1M LiCl:用去离子蒸馏水配制,滤膜过滤除菌;必要时用消毒去离子水稀释
2. 50% PEG3350 :Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制,滤膜过滤除菌,用较紧的盖子的瓶子分装
3. 2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20℃保存
注:醋酸锂对毕氏酵母无效,仅氯化锂有效;PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用;
毕氏酵母的转化
1. 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min,迅速冰浴以制备单链担体DNA;
2. 将感受态酵母菌离心,以Tips去除残余的LiCl溶液;
3. 对于每一个转化,按以下顺序加入:
50% PEG3350 240ul
1M LiCl 36ul
2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul
5~10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul
4. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体*分布均匀(约1min);
5. 30℃水浴孵育30min;
6. 42℃水浴热休克20~25min;
7. 6000~8000rpm离心收集酵母菌体;
8. 重悬酵母于1ml YPD培养基,30℃摇床孵育;
9. 1~4h后,取25~100ul菌液铺选择性培养基平板,于30℃培养2~3天鉴定(将表达菌株和对照菌株在固体培养基平板,30'c培养至转化子出现)
毕氏酵母PEG1000转化法
试剂
缓冲液A:1.0M Sorbitol,10mM Bicine,pH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol
缓冲液B:40%(w/v)PEG1000(sigma),0.2M Bicine,pH8.35
缓冲液C:0.15M NaCl,10mM Bicine,pH8.35
未污染的新鲜、试剂级DMSO,-70℃保存
注:1. 缓冲液A、B、C均用滤膜过滤,-20℃保存;
2. 将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞,其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降;如进行多样品的转化,建议按6样品/组进行);
待转化毕氏酵母的制备
1. 接种环接种Pachia pastoris于YPD平板,30℃培养2d;
2. 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中,30℃振荡培养过夜;
3. 取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养,待其OD值从0.1升到0.5~0.8;
4. 室温下3000g离心收集酵母菌体,50ml缓冲液A洗涤一次;
5. 重悬菌体于4ml缓冲液A中,按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中,每管加入11ulDMSO,混合后迅速于液氮中冷冻,
6. -70℃保存
毕氏酵母的转化
1. 将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中,直接加于冻结的酵母细胞中;加入担体DNA(40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA)以获得zui大转化率;
2. 37℃水浴孵育5min,中间混合样品1~2次;
3. 取出离心管,加入1.5ml缓冲液B,*混匀;
4. 30℃水浴孵育1h;
5. 室温下2000g离心10min,去除上清液,菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中;
6. 离心样品,去除上清液,轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中;
7. 将所有转化液铺于选择性平板,于30℃孵育3~4天后,鉴定;
毕赤酵母转化方法有4 种。zui常用的是电转化法和原生质体法,其中电转化法zui为方便,转化效率zui高,zui容易产生多拷贝整合。由于原生质体法必须首先制备去除细胞壁的原生质体细胞以利于DNA 进入,然后细胞再生细胞壁,产生转化体,而ZeocinR 抑制细胞壁的形成,导致不能产生转化体。因此利用ZeocinR作为选择标记的载体如p PICZ 系列,不能使用原生质体法进行转化