硝酸还原酶(NR)测试盒

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硝酸还原酶(NR)测试盒测定意义

硝酸还原酶(NiR)是一类能催化亚硝酸盐还原的酶，广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为NO或NH3，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。

测定原理

亚硝酸还原酶可将NO2—还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO2—减少，即540nm处吸光值的变化可反应土壤中亚硝酸还原酶的活性。

需自备的仪器和用品

天平、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、低温离心机。
样品中AA提取：

1.按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行室温匀浆，然后转移到1.5 mL EP 管中，盖紧后（防止水分散失）置于沸水浴提取15 min；自来水冷却后，8000g，，4℃离心10min，上清液置冰上待测。

2.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3.血清等液体：直接检测。

计算公式如下：

1、血清（浆）LAP活力的计算:

单位的定义：每mL血清（浆）每分钟生成1 nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=205.8×ΔA

2、组织、细菌或细胞中LAP活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=205.8×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(2000×V样÷V样总) ÷T=0.103×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.72×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000万。

注意事项：

1. 试剂盒中试剂三、试剂四和标准品均需临用前配制，且避光保存，配制好未使用完的4℃保存且3天内使用完毕。

2. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于2.5），用蒸馏水稀释后再测定。

3. 与茚三酮反应在570nm处无吸收峰，因此，570nm处测定结果不含这两种氨基酸的量。

4．检出限为100μmol/L。

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